Αντίθετα, ένα καλό ιστορικό C57BL/6 προτιμάται γενικά, καθώς δεν χρησιμοποιούνται πλέον ενδογαμικά εργαστηριακά φίλτρα και περισσότερες από τις συσκευές CRISPR χρησιμοποιούν το C57BL/6 ως γονιδίωμα αναφοράς. Οι περισσότερες προτάσεις γονιδιωματικής αλληλουχίας για την κατασκευή DNA δότη μπορούν να ληφθούν χάρη στη νέα Κοινοπραξία Αλληλούχισης Γονιδιώματος Ποντικού (MGSC). Η θέση κάθε στοχευμένης εγκατάστασης πρέπει να εξεταστεί προσεκτικά, ώστε να μην επηρεαστούν οι κανονιστικές απαιτήσεις. Ακόμα και μετά το CRISPR, μεγαλύτερες εισαγωγές μεγαλύτερες από 5 kb είναι δύσκολο να παραχθούν σε ποντίκια.
Για παράδειγμα, η δημιουργία ενός καλού υπό όρους αλληλόμορφου knockout, μόνο μία φορά το DNA δότη SS που έχει ένα/α εξόνιο/α με floxed θα λειτουργήσει πιο αποτελεσματικά από το να παίζεις απλώς με μερικά sgRNAs ώστε να μπορείς να εισάγεις ταυτόχρονα loxP ιστοσελίδες. Ωστόσο, όπως και στις πραγματικές συνθήκες στο ζυγωτό ποντικού, η επικύρωση των sgRNAs μπορεί να ελεγχθεί στην κοινότητα των ιστών εάν οι αρουραίοι δότες δεν έχουν ανάλυση βλαστοκύστης ποντικού (Went et al., 2013a). Ιστοσελίδες, όπως (Wang et al., 2013; Yang et al., 2013) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ελέγξουν την απόδοση επεξεργασίας γονιδιώματος πριν από τη λήψη, όπως τα κύτταρα Parece έχουν τις καλύτερες αποδόσεις HDR από τους σωματικούς μύες (Yu et al., 2015).
Σκέψεις ημέρας
Εκτός από τη συνολική απόδοση του sgRNA, μια άλλη ανησυχία σχετικά με την επεξεργασία γονιδιώματος είναι η πιθανότητα μεταλλάξεων εκτός διεύθυνσης, ειδικά όταν αναζητείται εξοικείωση με έναν εξαιρετικό φαινότυπο ποντικού. Τα περισσότερα λογισμικά σχεδίασης sgRNA CRIPSR παρέχουν μια λίστα πιθανών ιστοσελίδων εκτός διεύθυνσης, και, εάν είναι δυνατόν, μπορεί να εφαρμοστεί μια μέθοδος PCR για να εντοπιστούν αυτές οι μεταλλάξεις indel σε αυτές τις ιστοσελίδες χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία χημικής αναντιστοιχίας. Η αναπαραγωγή σε ένα καλό "καθαρό" ποντίκι άγριου τύπου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό τυχόν ανεπιθύμητων μεταλλάξεων (ιδανικά θα γίνουν τουλάχιστον δύο διασταυρώσεις για την αποφυγή μεταλλάξεων εκτός στόχου) (Raveux et al., 2017).
Βήμα 2. Ρύθμιση και δημιουργία γραμμικού υποστρώματος λόγω της PCR
Ωστόσο, θα χρειαστεί τροποποίηση των πρωτοκόλλων για την υπερωορρηξία και το εύρος του ζυγωτού σας, όταν χρησιμοποιούνται διάφορα άλλα στελέχη (Qin et al., 2016). Η χορήγηση του δικού σας sgRNA και του mRNA του Cas9 στο ζυγωτό του ποντικιού σας μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε μέσω κυτταροπλασματικών ενέσεων, συχνά χρησιμοποιώντας έναν καλό πιεζοηλεκτρικό μικροχειριστή, είτε μέσω προπυρηνικών ενέσεων, συνήθως με έναν καλό μικροεγχυτήρα (Yang et al., 2014). Γενικά, δεν παρατηρήθηκαν φαινοτυπικές διακυμάνσεις που να έχουν πιθανή μορφή χορήγησης (Horii et al., 2014).
Για να υπάρξει τροποποίηση γονιδιώματος στους ιστούς των θηλαστικών, αυτά τα ινδέλια θα αποκλείσουν ένα καλό γονίδιο ως αποτέλεσμα χωρίς κατάθεση Xon Bet για κινητά μιας μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου. Από την άλλη πλευρά, εάν το DNA του δότη είναι διαθέσιμο, το νέο DSB θα διορθωθεί με HDR, ακόμη και σε χαμηλότερη συχνότητα από το NHEJ. Το CRISPR-Cas9 αργότερα προσαρμόζεται για κληρονομικό χειρισμό σε ολόκληρα ζώα, όπως για να δημιουργήσει knockout και knockout ποντίκια.
Ο ανασυνδυασμός θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για διαγραφές, σημειακές μεταλλάξεις, διπλασιασμούς, αναστροφές, συγχωνεύσεις και πιθανές ετικέτες. Ένα καλό γραμμικό υπόστρωμα DNA που έχει την υποχρεωτική αλλαγή ή αλλιώς ομολογίες παράγεται στο DNA-στόχο σας στον μυ. Το Gam δεν είναι σίγουρα απαραίτητο για τον ανασυνδυασμό, ωστόσο, αυξάνει τη συχνότητα από τον ανασυνδυασμό dsDNA έως και 20-flex. Δοκιμάστε μια εξαιρετική εξωνουκλεάση DNA διπλής χορδής 5'→3' και αυτή είναι που θα χρειαστείτε για τον ανασυνδυασμό dsDNA. Οι νεότερες πρωτεΐνες Βήτα, μια εξαιρετική πρωτεΐνη ανόπτησης ssDNA, είναι η κεντρική ανασυνδυάση στον ανασυνδυασμό. Συγκεκριμένα, οι λειτουργίες ανασυνδυασμού, όπως οι μυστικές πρωτεΐνες ανασυνδυασμού RecA, που συνήθως απαιτούνται για τον ανασυνδυασμό.
Ανάλογα με τη διάταξη μακριά από την ιστοσελίδα loxP, ο νεότερος ανασυνδυασμός προκαλεί διαγραφή ή αναστροφές των γονιδίων της οικογένειας-στόχου. Λόγω των επαγώγιμων χαρακτηριστικών από το cre-loxP, το νεότερο knockout πιθανότατα θα προκληθεί από τις τοξίνες όπως η τετρακυκλίνη και η ταμοξιφάνη. Η τετρακυκλίνη ενεργοποιεί την νεότερη μεταγραφή της cre recombinase, ενώ η ταμοξιφάνη είναι υπεύθυνη για την πυρηνική μεταφορά. Οι πλευρικοί εκκινητές έχουν ως στόχο να δημιουργήσουν ένα προϊόν στο οποίο η ινδόλη βρίσκεται ασύμμετρα τοποθετημένη στη νέα συσκευή PCR. Η αναντιστοιχία αυτών των εκκινητών στη συνέχεια διασπάται από τη χημική ουσία T7E1 (WT – άγριος τύπος, HT – ετερόζυγο) για να βοηθήσει στην παραγωγή δύο ταχύτερων θραυσμάτων σε έναν ορό αγαρόζης.
Ενώ ο Ολιβάρες μετακινεί την περιοχή του στήθους του για να μπει στη νέα μάχη για τη δεξιά πλευρά του Καστίγιο, το overhand δεξί του Καστίγιο θα λειτουργήσει ως πλαίσιο για να εμποδίσει τον Ολιβάρες να πάρει το underhook. Όσον αφορά τον σωματότυπο, ο Καστίγιο αφήνει ένα uppercut για να δημιουργήσει χώρο ώστε να μπορεί να απομακρυνθεί από τη μάχη, επαναφέροντας το για να σας βοηθήσει σε μια καλή απόσταση. Ωστόσο, όταν ο Ολιβάρες δεν ήταν σε θέση να μπει στη μάχη στο αγαπημένο τους μέτωπο, η ικανότητά του να παίζει με τον σταθερό τους σύνδεσμο μειώνεται σημαντικά.
Και οι υψηλότερες διαγραφές και οι υψηλότερες γονιδιωματικές εισαγωγές έχουν αποδειχθεί ότι είναι ταυτόχρονα δυνατές χρησιμοποιώντας το CRISPR (Zhang et al., 2015). Η λήψη διδύμων sgRNA έχει επίσης προταθεί ως τρόπος αύξησης των πιθανοτήτων εμφάνισης νέου γονιδίου, ειδικά εάν απαιτείται τροποποίηση διαλληλικού γονιδίου (Zhou et al., 2014). Οι μεταλλάξεις εκτός στόχου έχουν κυρίως αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν τροποποίηση γονιδιώματος CRISPR στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, αλλά μπορεί να είναι σπάνιες σε ένα ζυγωτό ποντικού (Fu et al., 2013; Yang et al., 2013). Ωστόσο, οι μεταλλάξεις εκτός στόχου εξακολουθούν να είναι κάτι που συμβαίνει σε φυσικά δομημένους αρουραίους. Μία κάθετος Cas9n προκαλεί μόνο ένα σπάσιμο συμβολοσειράς που επιδιορθώνεται εύκολα. Επομένως, για να δημιουργηθεί ένα πραγματικό DSB, είναι απαραίτητα μερικά sgRNA. Η τεχνολογία CRISPR-Cas9 παρέχει κυρίως τροποποιημένα γονίδια με επίκεντρο τους εσωτερικούς ιστούς Parece, ενώ παράλληλα αποτελεί τρόπο τροποποίησης του γονιδιώματος στους αρουραίους, συμπεριλαμβανομένης της απλής δομής και του μικρότερου χρόνου που απαιτείται για την παραγωγή αρουραίων-γενετικών γονιδίων.
- Ενώ ο αστικός παίκτης των Ντουράν κεντράρει ταυτόχρονα την πρωτοπόρο πλευρά του Παλομίνο, ο Παλομίνο δυσκολεύεται να βάλει το δεξί κροσέ στο κεφάλι.
- Μια ενθουσιώδης ιστοσελίδα του EcoRI καταστράφηκε κατά την εγκατάσταση του δικού σας DNA δότη, ώστε να μπορείτε να υποστηρίξετε τον προσδιορισμό του γονότυπου του ποντικού knockin που παράγεται με CRISPR, όπου η ζώνη KI PCR δεν κόβεται από την περιοχή Lso.
- Ωστόσο, υψηλότερες εισαγωγές ή διαγραφές μπορεί να χρειαστούν μερικά sgRNA για να διαπεράσουν πλήρως το γονιδιωματικό DNA, ώστε μερικές φορές να αλλάξουν ή να εξαλειφθούν.
- Τα υπό όρους μοντέλα ποντικών προτιμώνται για την εξέταση της ατομικής κατάστασης, επειδή το ένα δείχνει ομοιότητα στον φαινότυπο όταν ορισμένα γονίδια έχουν διαγραφεί.
- Ένθετα μεγέθους 1–2 kb δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το CRISPR, ωστόσο τα αποτελέσματα από το HDR μειώνονται σημαντικά καθώς το μέγεθος της νέας ανάρτησης επεκτείνεται πέρα από αυτό το μέγεθος.
Πέρα από την ευκολία της ενδονουκλεάσης DNA του Cas9, το CRISPR επαναχρησιμοποιήθηκε επίσης για να ενσωματώσει μια δυναμική, καθοδηγούμενη από RNA μορφή μακριά από τη ρύθμιση της νέας μεταγραφικής δραστηριότητας από κατευθυνόμενα γονίδια. Αυτό επιτυγχάνεται με την εφαρμογή μιας εξαιρετικά απενεργοποιημένης Cas9 (dCas9) η οποία είναι συντηγμένη με μεταγραφικούς ενεργοποιητές, καταστολείς και πιθανούς επιγενετικούς τροποποιητές (Komor et al. 2017). Εναλλακτικά, η ενεργοποίηση γονιδίων ελέγχου που περιέχουν άγριου τύπου Cas9 μπορεί επίσης να επιτευχθεί με τροποποιημένα νεκρά sgRNAs που έχουν κατασκευαστεί με απταμερή φουρκέτας MS2. Αυτά τα νεκρά sgRNAs συντομεύονται για να αποτρέψουν τον σχηματισμό DSB επειδή τα απταμερή MS2 ενσωματώνουν μια πρωτεΐνη που είναι απαραίτητη για τον συνδυασμό, η οποία αποτελείται από τη νέα πρωτεΐνη στρώματος βακτηριοφάγου MS2 που σχετίζεται με έναν ισχυρό μεταγραφικό ενεργοποιητή (Liao et al 2017). Έτσι, η μέθοδος ενεργοποίησης γονιδίων-στόχων έχει αποδειχθεί σε αρουραίους ότι απομακρύνει την κατευθυνόμενη έκφραση από γενετικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι βοηθούν στην ανακούφιση ασθενειών όπως ο διαβήτης, η νεφρική νόσος και η μυϊκή δυστροφία.
Αυτά τα γονίδια που επικεντρώνονται στη διαδικασία, καθώς και η τελική ανάπτυξη της τεχνολογίας CRISPR-Cas9, μείωσαν τον χρόνο ανάπτυξης φυσικά τροποποιημένων ποντικών κατά 8-10 εβδομάδες, δηλαδή περίπου 3 μήνες. Η τεχνολογία CRISPR-Cas9, ωστόσο, έχει ουσιαστικά αντικαταστήσει τα ZFN και τα TALEN όσον αφορά την ευκολία δομής και την ικανότητα δόμησης (Εικ. 1). Τα ZFN και τα TALEN απαιτούν σύστημα μακριά από πολυμερείς περιοχές δέσμευσης DNA ανά νέο γονιδιωματικό στόχο. Το CRISPR βασίζεται στον σχηματισμό ενός εξαιρετικού ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου μεταξύ της DNA ενδονουκλεάσης Cas9 και μπορεί να σας «οδηγήσει» σε ένα RNA που στέλνει όπου ένα καλό γονιδιωματικό DSB συμβαίνει στα 20bp μακριά από την αντίστοιχη υποκείμενη διαδοχή.